非洲猪瘟病毒荧光PCR检测的试验误差及临界值样品的重复性张鹤晓中国海关科学技术研究中心.pdf

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1、 01 02 03 结果可靠技术成熟 专业生产操作熟练质量稳定应用闭环 GSIDEXX“质量过硬”的试剂盒可有效保证检测结果的准确性森康生物 人员操作、软件使用差异测量方法不同；样品处理方法不同仪器未经校正/设备损耗抽样/加样时数量、均匀度、组间分配的差异暂时无法控制的微小因素所造成的误差样品采集、处理、提取的差异 随机误差 误差的种类、来源生物多变性误差抽样/加样误差 系统误差仪器误差操作误差测量方法误差偶然误差不同厂家的试剂（组分的纯度、杂质等）和耗材实验室环境、通风等试剂、耗材差异条件差异荧光荧光PCR检测的检测的试验误差贯穿试验误差贯穿样品采集、处理、核酸提取、加样、扩增样品采集、处理

2、、核酸提取、加样、扩增全过程。全过程。采样误差采样误差样品处理误差样品处理误差核酸提取误差核酸提取误差时机、部位、方法、保存液、保存温度、运输时间时机、部位、方法、保存液、保存温度、运输时间.部位、取样量、稀释液与样品的比例、研磨或匀部位、取样量、稀释液与样品的比例、研磨或匀浆是否彻底、抗凝剂成分、抑制成分是否去除、浆是否彻底、抗凝剂成分、抑制成分是否去除、离心的转速、样品中的病原是否灭活离心的转速、样品中的病原是否灭活等。等。试剂盒提取效率、污染防护、抑制成分试剂盒提取效率、污染防护、抑制成分等。等。核酸的均匀性对荧光PCR试验也非常重要，特别是做标准曲线时，核酸的正确稀释与否及均匀与否都会

3、影响曲线的准确性。样品的生物多变性误差样品的生物多变性误差 抽抽样误差样误差加样加样误差误差拭子样品是否混匀、混样是否充分、抽样拭子样品是否混匀、混样是否充分、抽样代表性。代表性。加样量是否准确加样量是否准确、是否正确使用加样器、量程是是否正确使用加样器、量程是否与加样量否与加样量匹配。匹配。抽样抽样/加样加样误差误差 偶然偶然误差误差MMCVMSD核酸拷贝数 当样品中核酸拷贝数较高时当样品中核酸拷贝数较高时例如：例如：核酸拷贝数达到核酸拷贝数达到104时时，每次的加样误差就会很小（，每次的加样误差就会很小（1%），），这时仪器扩增后测出的这时仪器扩增后测出的Ct值变化就很小，仅在荧光值上稍稍

4、有差别，值变化就很小，仅在荧光值上稍稍有差别，如上图如上图A。偶然加样偶然加样误差误差当样品中核酸拷贝数较低时当样品中核酸拷贝数较低时例如：例如：Ct值大于值大于30，这时每次检测加样的误差就会变大，不同于，这时每次检测加样的误差就会变大，不同于Ct值值小于小于30的样品的样品扩增曲线扩增曲线，此类检测中，复测孔扩增曲线基本重叠，但，此类检测中，复测孔扩增曲线基本重叠，但曲线有逐渐拉开距离的现象，尤其当样品中核酸拷贝数接近检测临界曲线有逐渐拉开距离的现象，尤其当样品中核酸拷贝数接近检测临界值时，复测孔还可能出现扩增曲线时有值时，复测孔还可能出现扩增曲线时有/时时没有的情况，如上图没有的情况，如

5、上图B。图图A图图B 荧光荧光PCR仪品牌、型号影响仪品牌、型号影响Ct值，荧光值，荧光PCR仪的误差主要由热模块孔间温度的均匀性、仪的误差主要由热模块孔间温度的均匀性、热模块的清洁度、升降温速度、荧光采集元件的灵敏度、光源、软件的计算等引起热模块的清洁度、升降温速度、荧光采集元件的灵敏度、光源、软件的计算等引起。荧光荧光PCR仪误差仪误差加样器误差加样器误差 使用未校准有误差的加样器、使用劣质吸头、同一加样器加核酸浓度较高的样品、阳性使用未校准有误差的加样器、使用劣质吸头、同一加样器加核酸浓度较高的样品、阳性 对照和其他待检样品对照和其他待检样品。系统误差系统误差-仪器仪器误差误差 核酸提取

6、仪核酸提取仪品牌、防污染设计能力、磁珠的吸附能力、洗涤是否充分、洗脱是否品牌、防污染设计能力、磁珠的吸附能力、洗涤是否充分、洗脱是否彻底。彻底。核酸提取仪误差 人员操作人员操作误差误差软件使用软件使用误差误差样品核酸的样品核酸的处理、保存处理、保存反应管的摆放是否正确、荧光通道选择是否正确、反应参数设置是否准确、基线的设置是否合理等反应管的摆放是否正确、荧光通道选择是否正确、反应参数设置是否准确、基线的设置是否合理等软件版本是否与仪器匹配、是否准确使用、对于无软件版本是否与仪器匹配、是否准确使用、对于无Ct值有扩增曲线及有值有扩增曲线及有Ct值无扩增曲线的处理等值无扩增曲线的处理等系统误差系统